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    公开号:WO1991019981A1
    申请号:PCT/JP1991/000845
    申请日:1991-06-21
    公开日:1991-12-26
    发明作者:Shigenori Tanaka
    申请人:Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 害
    [0002] ( 1 → 3 ) — /3— D—グルカ ンの測定剤
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は、 カブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセー トを用いる
    [0005] ( 1 → 3 ) — — D—グルカ ンの測定剤に関する。
    [0006] 背景技術
    [0007] 力ブ トガニ ' ァメ ボサイ ト · ライセー ト （以下、 単にライセ ー ト という） を使用して、 エン ド トキシ ンを測定する方法が知 られている。 この方法は、 ライセー トが微量のエン ド トキシ ン により凝固することに基づいているが、 その後の生化学的解明 により、 該凝固反応はいく つかの凝固因子の段階的活性化によ りおこることが明らかにされている （中村隆範ほか、 日本細菌 学雑誌、 38、 781-803(1983) )0
    [0008] すなわち、 第 1 図に示すように、 ライセー トにエン ド トキシ ンが加わると C因子 （エン ド トキシン感受性因子、 分子量 123 , 000)を活性化して活性型 C因子となり、 これは B因子 （分子量 64,000 ) を限定水解し、 活性化して活性型 B因子となり、 これ はプロクロ ッティ ングェンザィム （分子量 54,000) を活性化し てクロ ッティ ングェンザィムに変換する。 ク ロ ッティ ングェン ザィムはコアギュローゲン （凝固タ ンパク、 分子量 19,723) の Arg18 -Thr^ 9 と Arg"-G:iy< 7 の特定箇所'を限定水解する こ と に よりペプチ ド Cを遊離し、 コアギュローゲンをコアギュ リ ンに 変換して凝固 （ゲル化） させる。 岩永らの方法 （Haemostasis, 7, 183-188(1978) ) によ り、 さ らにこのコアギュ口一ゲンの水 解部位と共通のア ミ ノ酸配列を持った合成ぺプチ ド、 すなわち 発色合成基質 Boc -： Leu - Gly - Arg - p —二 卜ロアニリ ド （pNA)ある いは発蛍光合成基質 Boc-Leu-Gly-Arg- 4 一メ チルクマ リ ル一 7 —ア ミ ドとライセ一トを組み合わせた定量性のある測定法が知 られている。 該測定法は、 エン ド トキシ ンが引金 （ ト リ ガ一） となって複数の凝固因子 （全てセ リ ンプロテアーゼ前駆体） を 順次活性化するカスケー ド機構によって、 最終的にコアギユ リ ンゲルを形成するという一連の反応を利用している。
    [0009] また、 ライセー トに （ 1 → 3 ) — ;5 — D —グルカ ンが加わる と、 第 1 図における G因子を活性化して活性型 G因子となり、 これがプロクロッティ ングェンザィムをクロッティ ングェンザ ィムに変換し、 エン ド トキシ ンの場合と同様にクロ ッティ ング ェンザィムがコアギュローゲンをコアギユ リ ンに変換してゲル を形成し、 また合成基質を水解する （森田ら、 FEBS Lett. , 129, 318-321(1981) )0
    [0010] この G因子に反応する物質と しては （ 1 → 3 ) 一 β - Ό ー グ ルカ ン、 ク レスチン、 レ ンチナンなど、 さ らにはセルロース系 血液透析膜の洗浄液中及び該膜と接触した血液中に含まれる物 質などが知られており、 これらはいずれもゥサギ発熱試験によ り発熱性を示さないこと も認められている。
    [0011] 一方、 （ 1 → 3 ) — 9 一 D —グルカ ンは真菌細胞壁の構成多 糖体と しても知られ、 特に血液中の （ 1 → 3 ) — 3 — D — グル カ ンを測定するこ と によ り体内における真菌の存在を検知する こ とができ るので、 （ 1 → 3 ) — ー D—グルカ ンをエン ド ト キシ ンの影響を全く 受けずに、 高い感度で再現性良く 測定し得 る方法が特に臨床検査医学の分野で望まれている。
    [0012] また、 抗 C因子モノ ク ローナル抗体を 17種作成し、 そのェ ピ トープ領域を同定すると共に、 C因子活性化に対する影響を調 ベた報告がなされている （三浦芳樹ら、 生化学、 ^：, No.9 ,834
    [0013] Γΐρ- Aj06 リ ポ多糖感受性セ リ ンプロテアーゼ前駆体 （ C因子） のモノ ク ローナル抗体の同定とその活性化機作解析への応用」 、 平成元年 9月 25日、 財団法人日本生化学会発行） 。
    [0014] ライセー ト中の G因子を用いることにより （ 1 → 3 ) — β —
    [0015] D—グルカ ンを測定する方法が報告されている （大林ら、 Clin, Chim. Acta. 149, 55-65(1985 ))が、 この方法はライセー トを ゲル濾過法によ り あるいはへパ リ ンまたはデキス ト ラ ン硫酸を 固定化したァフィ 二ティ一担体を用いるクロマ トグラフィ 一に より分画し、 エン ド トキシ ン感受生の C因子を除去することに よ り、 G因子とプロ ク ロ ッ ティ ングェンザィムのみで再構成す るもので、 きわめて煩雑な操作を必要とする方法である。 発明の開示
    [0016] 本発明は、 エン ド トキシ ン感受性因子に対する抗体を使用 し、 ェン ド トキシン感受性の C因子の影響を受けずに、 ライセー ト 中の G因子による反応を利用 して （ 1 → 3 ) 一 β — Ό一ゲ 力 ンを測定する試薬に関する。
    [0017] すなわち、 本発明の （ 1 → 3 ) — ； S— D—グルカ ンの測定剤 は、 (1) ライセー ト と、 エン ド トキシン感受性因子に対する抗体 とからなる （ 1 → 3 ) — /3 — D—グルカ ンの測定剤、 および
    [0018] (2) エ ン ド トキシ ン感受性因子に対する抗体を固定化した担 体に、 ライセー トを接触させて得たエン ド トキシ ン感受性因子 不含ライセー トからなる （ 1 → 3 ) — 3— D—グルカ ンの測定 剤、 である。
    [0019] エン ド トキシ ン感受性因子は、 前述したようにエ ン ド トキシ ンによつて活性化される C因子およびこの活性型 C因子により 活性化される B因子であり、 （ 1 → 3 ) — S— D—グルカ ンを ェン ド トキシ ンの影響を受けることなく特異的に測定するには、 ライセー トに含まれるこれら Cおよび B因子の影響を排除しな ければならない。 このため本発明では C因子または Cおよび B の混合因子 （ C B因子） に対する抗体をライセー ト と共に用い るか、 または抗 C因子固定化による C因子不含ライセ一 トを用 いる ものである。
    [0020] 本発明で使用するライセー トは、 リ ムルス · ポリ フ ヱ ムス
    [0021] ( L.polyphemus、 アメ リ カ産） 、 タキプレウス ' ギガス （T. gigas 、 タイ国、 マレーシア半島産） 、 タキプレウス · ト リ デ ンタツス（T.tridentatus、 日本産） 、 カルシノスコノレピウス . ロッンディ力ウダ （ C. rotundicauda、 タイ国、 マレーシア半島 産） 等のカブ トガ二から血リ ンパ液を採取し、 次いで該血球を 破砕し、 その成分 （ライセ一 ト） を分離する。 ライセー トは— 40で以下に小分けして保存し、 必要に応じ凍結融解して使用す るのが望ま しい。
    [0022] 得られたライセー 卜から C因子に対する抗体を製造するには まず抗原となる C因子を精製しなければならないが、 この方法 と しては、 ァガロース、 セフ ァ ロース （フ アルマシア社販売、 商品名） 、 またはその架橋体等の適当な担体にデキス ト ラ ン硫 酸、 へパ リ ン等を固定化したものにライセー トを接触させ、 C または C B因子を含む画分を採取する方法を採用する こ とがで きる。 接触させる方法と しては、 例えば、 上記固定化物とライ セ一 卜 とを溶液中で接触させる方法、 カラムクロマ トグラフィ 一により接触させる方法等を挙げることができる。
    [0023] エン ド トキシ ン感受性因子を抗原とする抗体は、 精製したェ ン ド トキシン感受性の C因子または Cおよび C B因子を抗原と して使用し、 これら抗原に対するポリ クローナル抗体およびモ ノ ク ローナル抗体を製造する。
    [0024] 本発明で使用するポ リ クローナル抗体の製造方法と しては、 該抗原をゥサギ、 ャギ等の被免疫動物に投与し、 得られた抗体 を、 さ らに精製することが望ま しい。 被免疫動物に投与する際 に、 捕助剤 （アジュバン ド） を併用することは抗体産生細胞を 賦活するので望ま しい。
    [0025] 本発明で使用するモノ クローナル抗体の製造方法と しては、 該抗原をマウスまたはラ ッ 卜の腹腔内に投与した後に脾臓など を摘出し、 該脾臓などから採取した細胞と腫瘍細胞株である ミ エローマ細胞とを細胞融合させて、 ハイプリ ドーマを樹立し、 得られたハイ プリ ドーマを試験管内にて連続増殖させ、 さ らに 得られたハイプリ ドーマから上記抗原に対する特異抗体を連続 的に産生する細胞株を選別し、 この選別株を試験官内培養また はマウスの腹腔などの生体内にて培養するこ とによって、 モノ クローナル抗体を大量に製造する方法を挙げることができる。 細胞融合に用いる細胞と しては、 脾細胞以外にリ ンパ節細胞お よび末梢血中のリ ンパ細胞等を用いることができる。 また、 ミ エローマ細胞株は、 異種細胞種由来のものに比べ同種細胞株由 来のものが望ま し く 、 安定な抗体産生ハイ プリ ドー マを得る こ とができる。
    [0026] 得られたポリ クローナル抗体およびモノ クロ一ナル抗体の精 製法と しては、 硫酸ナ ト リ ウム、 硫酸アンモニゥム等の中性塩 による塩析、 低温アルコール沈澱およびポ リェチレダリ コール または等電点による選択的沈澱分別法、 ないしは電気泳動、 DE AE、 CM-誘導体等のイオン交換体やプロティ ン Aならびにハイ ドロキシァパタイ ト吸着体による吸脱着法、 ゲル濾過および超 遠心法等を挙げることができる。
    [0027] ( 1 → 3 ) —；3 — D —グルカ ンを測定する上記 (1)の方法にお いて、 該抗体をライセー ト と （ 1 → 3 ) 一 β — Ό—グルカ ン溶 液中に存在させるには、 例えばライセー トの凍結乾燥品を蒸留 水あるいは適当な緩衝液で溶解して調製した溶液に、 該抗体溶 液を添加する方法、 ライセー ト中に予め必要量の抗体溶液を共 存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な緩衝液で 溶解して用いる方法、 ライセー ト と合成基質の凍結乾燥品を適 当な緩衝液等で溶解して調製した溶液に、 該抗体溶液を添加す る方法、 ライセー ト と合成基質の混合液中に予め必要量の抗体 溶液を共存させ凍結乾燥して得た試薬を蒸留水あるいは適当な 緩衝液で溶解して用いる方法、 および必要量の該抗体溶液を試 料に添加する方法等が挙げられる。 また、 上記 (2)の方法に用いる該抗体の固定化担体にライセ一 卜を接触させて C因子を含まないライセ一 トを得る方法と して は、 該担体にライセー トを接触させた後に、 遠心分離、 濾過等 の手法により該担体を除去する方法、 あるいは該担体を充塡し たカ ラ ムにライセー トを添加してその素通り画分を集める方法 等が挙げられる。
    [0028] 該抗体の固定化担体と しては、 例えばセル口フ ァ イ ン （生化 学工業株式会社 販売、 商品名） またはセフ ァ ロ一ス等の適当 な担体の水酸基と、 抗体のア ミ ノ基とを通常の方法によ り共有 結合させた固定化担体を用いることができる。 担体と しては、 この他に もセルロース、 ァガロース、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ド、 デ キス ト ラ ン、 多孔性シ リ カ ビーズ等を用いることができる。
    [0029] さ らにこれらの担体に該抗体を固定化させる方法と して、 担 体に活性基を導入したのち、 抗体を結合させる方法、 例えば担 体をエポキシ活性化後ホルミ ル化したのち、 抗体を結合させる 方法等を挙げることができる。
    [0030] ライセー トを固定化担体に接触させる場合の PHと しては、 ラ イセー ト中の G因子および （ 1 → 3 ) — ;3— D —グルカ ンと G 因子により開始される経路に関与する凝固因子が不活化されな い程度の PHであれば良い力 、 好ま し く は PH 6〜 9の範囲が好 ま しい。 また、 接触させる場合の温度と しては、 該凝固因子が 同様に不活化されない温度であれば良いが、 通常 0〜 45°C、 よ り好ま し く は 0〜 10°Cである。
    [0031] 本発明により、 （ 1 → 3 ) — yS — D —グルカ ンを測定する生 体試料と しては、 血液、 血漿または血清の他に、 脳脊髄液、 腹 水、 関節液、 胸水および尿などの体内外の浸出または排泄液を 挙げることができる。 たとえば、 血漿を試料とするときは、 へ パリ ン、 EDTA、 クェン酸等の抗凝固剤を加えて分離するこ とが J必要である。
    [0032] 本発明の測定剤を用いて （ 1 → 3 ) — ー D —グルカ ンを測 定するには、 前述の発色合成基質あるいは発蛍光合成基質を反 応液中に共存させ、 クロッティ ングェンザィムのア ミ ダーゼ活 性を測定する方法、 凝固反応によるゲル形成の有無を肉眼的に 調べるゲル化法、 凝固に伴って生ずる濁度を適当な光学系を用 いて測定する比濁法、 一定の濁度に達するまでの時間を適当な 光学系を用いて測定する比濁時間分析法、 凝固に伴って生ずる 粘性の変化を共振周波数の変化と してと らぇ、 水晶振動子ゲル 化測定装置を用いて測定する方法等を採用することができる。 本発明の （ 1→ 3 ) —；3— D —グルカ ンの測定剤は、 C因子 に対する抗体を使用しているので、 少量でも優れた C因子に対 する特異的結合能および中和効果を示すことが第一の特徴であ る。 また、 該抗体はリ ムルス反応阻害物質と して知られている アンチ ト リ プシン、 アンチ トロンビン m等のプロテアーゼィ ン ヒビター類を含まず、 G因子活性を全く損なわないことが第二 の特徴である。 図面の簡単な説明
    [0033] 第 1 図はカブ トガニ血液凝固系のカスケー ド機構を示す。 第 2図は A剤、 D剤のエン ド トキシ ンに対する反応性を示す 第 3図は A、 D剤の （ 1 → 3 ) — — D —グルカ ンに対する反 応性を示す。 第 4 図は （ 1 → 3 ) — — D—グルカ ンの水及び ェン ド トキシ ン添加希釈液に対する D剤の反応性を示す。
    [0034] 第 5図は実施例 8~10の （ 1 → 3 ) — S — D -グルカ ンの検量 線を示す。 発明を実施するための最良の形態
    [0035] 以下に実施例を挙げ、 本発明をさ らに具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限定される ものではない。
    [0036] 実施例 1
    [0037] Bおよび C因子に対するポ リ ク ローナル抗体の製造
    [0038] 力ブ トガニ血リ ンパ液 1. 0 ^を 4 °C下に、 1 , 500rpmで 10分間 遠心し、 その沈澱部分 （ァメ ーボサイ ト） 約 50gに 25( dの 0.02M ト リ ス—塩酸緩衝液 （ρΗ β.Ο) を加え、 ホモゲナイザー (ポ リ トロン R PT10 (商標） 、 Kinematics社製） にて均一に破 砕及び抽出し、 冷却遠心分離機 （ ト ミ 一精ェ RD-20 m ) にて、 10,000rpm で 30分間遠心した。 得られた沈澱物をさ らに 150„^ の同上緩衝液にて 2回抽出し、 最終的に 55(½ のライセー トを 得た。
    [0039] 同ラ イ セー ト全量を、 デキス ト ラ ン硫酸固定化セフ ァ ロース CL-6B カラム （ 5 X 23cm、 0.05M NaCl含有 0.02M ト リ ス—塩酸 緩衝液 （PH8.0)で平衡化） に添加し、 0.45M NaCl含有 0.02M ト リ ス一塩酸緩衝液 （PH8.0)にて溶出される画分、 すなわち第 1 図に示す Bおよび C因子を含む B C画分を、 後記する大林らの 方法 ( Clin, Chim, Acta、 149, 55 - 65 ( 1985 ) )によ り、 その活 性を測定した。 ついでその 40 を 10^に減圧濃縮後、 C， B両 因子の活性化を防ぐために 0 · 23 gの EDTA-4N3を添加した。
    [0040] その に等量のフ ロイ ン ト コ ンプリ ー ト アジュバン ト (ャ ト ロ ン社販売、 商品名） を加え、 ゥサギ （JW 2.5 kg ) の背中、 尻および横腹のそれぞれに 0.3 、 0.3^および 0.4 m£ずつ皮下注射 （感作） した。 感作は 2週間に 1 度計 5回行い、 ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確認後、 最終感作日よ り 1 週間後に頸静脈を切開して全採血した。 ひきつづき室温 1 時間、 4 °C一晩放置後、 2,000rpmで 5分間遠心分離を行い、 得 られた血清 55^に 56°Cで 30分間の熱処理を行い非働化した後、 防腐剤と して 0.06gのアジ化ナ ト リ ウム （0.1 （W/V) を添加し た。 その血清の 48 ^に対して 34% (W/V)Na2SO* 溶液を 48^加え、 生じた沈濺を 10,000rpm で 30分間遠心分離し沈澱を 17% (W/V) Na, SO«溶液で 2回洗浄し、 その沈濺を 0.1M ト リ スー塩酸緩衝 液 （PH8.0)50J ^に溶解した。 この溶液に、 固形の Na2 SO< 7.5g を携拌しながら溶かし込み、 生じた沈緞を上記と同様の ト リ ス 一塩酸緩衝液に溶かし、 さ らに Na,SO 濃度 7.5g ,50^の条件 で沈澱操作を 3回繰り返し、 最終沈澱を上記緩衝液に溶解した。 ひきつづき 0 · 05M NH* HC03 で平衡化したセルロフ ァ ィ ン GH-20m (生化学工業株式会社販売、 商品名） カラム （ 2.8x 90cm、 0.05MNH4 HC03 で溶出） を通過させ脱塩した後、 凍結乾燥し、 ゥサギ抗 （ B C画分） 血清の igG溶液を得た。
    [0041] 〔 Cおよび B因子活性測定法〕
    [0042] 0.2 M ト リ ス—塩酸緩衝液 （PH 8.0、 0.013M MgCl2 含有） 0.1^に、 E. c oli 0111： B 4 由来のエ ン ド トキシ ン （ 600ng Zn£) 30^fを加え、 さ らに各画分 50^を添加後、 3フでで 15分間 加温する。 ひきつづき、 0.005 M N—ターシャ リ ーブ トキシ 力ノレ； 二ノレ（Boc)—: Leu— Gly— Arg— pNA( p —二 卜 ロアニ リ ド） 20μ£ と凝固酵素前駔体 （プロク ロ ッティ ングェンザィム） を加 え、 37°Cで反応させる。 発色が認められることを確認し、 0.6 Mの酢酸 0.8^を添加する こ と によ り反応を停止し、 次いで 405 nmの吸光度を測定する。
    [0043] 実施例 2
    [0044] 精製 C因子に対するポ リ ク ローナル抗体の製造
    [0045] 力ブ トガニ血リ ンパ 1.2^ を 4 °C下に l,500rpmで 10分間遠心 し、 その沈澱部分 （ァメ ーボサイ ト） 約 53g に 25(½ の 0.02M ト リ ス—塩酸緩衝液 （PH 8.0、 0.05MNaCl、 0.001Mベンズァ ミ ジ ン、 0.001M EDTA-4Na含有） を加え、 実施例 1 と同様に 破砕、 抽出後、 10,000rpm で 30分間遠心した。 得られた沈澱を 200；^の同上緩銜液にてさ らに 2回抽出し、 最終的に 640^の ライセー トを得た。
    [0046] 同ライセー ト全量を、 デキス トラ ン硫酸固定化セファ ロース CL-6B カ ラム （ 5 X 23 · 5cm、 0.05M NaCl含有 0.02M ト リ ス一塩 酸緩衝液、 PH 8.0で平衡化） に添加し、 0.5 MNaCl含有 0·02Μ ト リ ス—塩酸緩衝液 （ΡΗ 8.0) にて溶出される画分 （ Β因子お よび C因子、 活性測定法は後記する中村らの Eur. J. Biochem. , 154, 511-521(1986) 記載の方法による） を限外濾過 （ダイァ フ ロー ' メ ンブレ ン ΡΜ10、 ア ミ コ ン社） にて濃縮し、 セフ ァ ロ —ス CL-6B (フ ア ルマ シア社製） カ ラ ム （ 4.0X l29cm、 0.1M NaClを含む 0.02M酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液、 PH 5.0で平衡化） に よるゲル濾過および C M—セフ ァ ロース CL-6B (フ アルマシア社 製） カラム （ 2·ΟΧ 25αη、 前記と同様の緩衝液で平衡化し、 0.1 Μから 0.35Μまでの NaClグラジヱ ン トで溶出） によるイオン交 换にて、 精製 C因子 15.5mgを得た。 精製 C因子の純度を S D S ポリ アク リ ルア ミ ド電気泳動にて検討した結果、 非還元条件下 にて 1本の明瞭なバン ド、 還元条件下では 2本のバン ドに分力ヽ れた。 このことより、 当該 C因子は、 S— S結合で結ばれた 2 本のポリペプチ ド鎖から成る高純度の精製標品であることが明 らカ、であろう。
    [0047] 〔 C因子活性測定法〕
    [0048] 1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH 8.0、 0.05MMgCl2 含有） 20 μί に、 E. coli 0111： B4由来のエン ド トキシ ン （ / ml) 4≠ を加え、 さ らに各画分 10— を添加後全量を 200^と し、 37 °Cで 10分間加温する o ひきつづき、 0.002M Boc-Val-Pro-Arg-pN A を加え、 37°Cで 7分間加温する。 0.6Mの齚酸 0.8； ^を 添加して反応を停止し、 405nm の吸光度を測定する。
    [0049] 〔B因子活性測定法〕
    [0050] 1 M ト リ ス—塩酸緩衝液 （PH 8.0、 0.05M gCl2 含有） 20μί に活性型 C因子溶液 （ C因子よりエン ド トキシ ン添加にて調製、 を添加後全量を 200 /^と し、 37°Cで 10分間加温する。 ひきつづき、 0.005M Boc-Leu -Gly-Arg-pNA20^と凝固酵素前駆体 （プロク ロ ッティ ングェン ザィム、 0.96m Zm 30/^を加え、 37°Cで 3分間加温する。
    [0051] 0.6 Mの酢酸 0·8 ^を添加して反応を停止し、 405nm の吸光度 を測定する。
    [0052] 上記により精製した C因子溶液 40^を に濃縮後、 C因子 の活性化を防ぐため 0.23gの EDTA-4Naを添加した。 その 1.0„£ に等量のフ ロイ ン ト コ ンプリ ー ト アジュバン トを加え、 ゥサギ (JW、 、 2.5 kg) の背中、 尻および横腹のそれぞれに 0.3^、 0.3 および 0.4^づっ皮下注射 （感作） した。 感作は 2週間 に 1 度計 5 回行い、 ゲル内二重拡散法により抗体価の上昇を確 認後、 最終感作日より 1週間後の頸静脈切開により全採血した。 ひきつづき室温 1 時間、 4 で一晩放置後、 2,000rpmで 5 分間 遠心分離を行い、 得られた血清 62^に 56°Cで 30分間の熱処理 を行い非働化した後、 防腐剤と して 0.06g のアジ化ナ ト リ ゥ ム （ 0.1%(W/V) )を添加 した。 48^の血清に対 して 34% (W/V) Na2 S04溶液を 48mi加え、 生じた沈澱を 10 , OOOrpm で 30分間遠心 分離し、 沈殿を 17% (W/V)Na2S04 溶液で 2回洗浄し、 その沈澱 を 0.1M ト リ スー塩酸緩衝液 （ΡΗ8.0)5(½ηこ溶解した。 この溶 液に固形の Na, S04 7 · 5 gを援拌しながら溶かし込み、 生じた沈 澱を上記と同様の ト リ スー塩酸緩衝液に溶かし、 さ らに Na2 SO* 濃度 7.5gZ5(½ の条件で沈澱操作を 3回繰り返し、 最終沈澱を 上記緩衝液に溶解した。 ひきつづき 0.05Mの NH4HC03 で平衡し たセル口 フ ァ イ ン GH-20mカラム （2.8X 90cm、 0.05M NH« HC03 にて溶出） を通過させ脱塩した後、 凍結乾燥し、 抗 C因子血清 の IgG 溶液を得た。
    [0053] 実施例 3
    [0054] 精製 C因子に対するモノ ク ローナル抗体の製造
    [0055] 実施例 2で得られた C因子 0.5^ (タ ンパク量、
    [0056] を等量のフロイ ン ト コ ンプリ ー トアジュバン 卜 と混合し、 マウ ス （BALB/C、 5週令、 体重 25g ) の背中に 0.2^および尻に 0.3 を皮下注射し、 2度目の感作を 2週目に行い、 3週後に 300 の C因子 0.3^を静脈内投与し最終免疫と した。 こ れより 4 日後に 9.3X 107 個の脾細胞を分離し、 マウス ミ エ口 一マ S P / 0細胞の 1.9X 107 個と常法により融合させて、 ハ ィ プリ ドーマを作成した。 得られたハイプリ ドーマにつき、 C 因子に結合すること、 または C因子活性を中和させることがで きることを確認した。 つづいて、 上記と同様のマウス腹腔内に プリ スタン （2, 6, 10, 14-テ トラメチルペン夕デカ ン） を Q.2jd 投与し、 1週後にハイプリ ドーマ 3 X 107 匹を腹腔内に投与 し、 腹水の大量貯留がみられる 2週目に腹水を回収し、 40%飽 和硫酸アンモニゥムで igG 画分を沈澱させ、 最終的な腹水型モ ノ ク ローナル抗体を得た。
    [0057] 実施例 4
    [0058] 抗 C因子固定化セル口フ ァ イ ンによる C因子不含ライセ一ト の調製
    [0059] 実施例 1 に記載の方法で得られたライセー ト を、 0.1M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH 8.0、 0.15M NaCl含有） で平衡化した ェン ド トキシンおよび ^ーグルカ ン不含の抗 C因子固定化セル 口フ ァ イ ン （調製方法は後記） カラム （1.3 X 12cm ) に添加し、 0.1 M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH 8.0、 1 M NaCl含有） にて洗浄 後、 素通り した非吸着画分を集め、 C因子を全く 含まない C因 子不含ライセ一トを得た。
    [0060] 〔抗 C因子固定化セルロフ アイ ンの調製方法〕
    [0061] ホルミ ルセル口フ ァイ ン 10 gを 0 · 1Mリ ン酸一 Na緩衝液 （ pH 7.1)で充分洗浄し、 実施例 1〜 4 に記載の C因子に対する抗体 溶液 （lOmg/ 0.1Mリ ン酸— Na緩衝液、 pH7 · 1 ) 10m に懸濁し、 NaCNBH3 50mgを加え溶解させる。 ひきつづき室温で 8時間ゆる やかに攪拌し、 0.2Mト リ ス—塩酸緩衝液 （PH 7.0) で洗浄、 濾 過し、 10mgの NaCNBH3 を含む の上記緩衝液を加え、 室温で 3時間振と うする。 その後、 0.1M ト リ スー塩酸緩衝液 （PH 8.0 、 0.15MNaCl含有） で充分洗浄する。
    [0062] 実施例 5
    [0063] ポリ ク ローナル抗体を使用する （ 1— 3 ) 一 β— Ό ー グルカ ンの測定
    [0064] 以下の方法で 3種類の試薬を調製し、 3種類の試料について その反応性を比較検討した。
    [0065] Α剤は、 ライセー ト 440^、 塩化マグネ シウム 440^モル、 および Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 2.86〃モルを混合し、 凍結乾燥し て調製した。 B剤は、 A剤の成分に実施例 1で調製した抗 B C 画分血清の IgG 画分の lOm /^0.02M ト リ ス—塩酸緩衝液 （PH
    [0066] 8.0) を添加、 混合し、 凍結乾燥して調製した。 C剤は A 剤の成分に実施例 3で調製した抗 C因子血清の igG 画分の lOmg
    [0067] ト リ スー塩酸緩衝液 220μ£を添加、 混合し、 凍結乾 燥して調製した。
    [0068] 3種類の試薬それぞれを 2.2^の 0.2Μ ト リ スー塩酸緩衝液
    [0069] (ΡΗ 8.0) に溶解させ、 その溶液 を試験管に分注し、 そ こへ試料 0.1^を添加してよ く 混合し， 37°Cにて 30分間反応さ せた。 3種類の試薬に対する試料の反応性は、 30分後に生じた pNA を、 0.5^の 0.04%亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0.48M塩酸溶液を 含む） 、 0.3 スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0.07% N— ( 1 — ナフチル） エチレンジア ミ ンニ塩酸塩を順次添加して発色させ 545mn の吸光度値で示した。 その結果を第 1表に示した。 この 結果から、 B C画分に対するポ リ ク ローナル抗体及び C因子に 対するポリ クローナル抗体を添加して調製した試薬を用いれば エ ン ド トキシ ンの影響を全く受けずに、 （ 1 → 3 ) - β - Ό - グルカ ンを特異的に定量することができることは明らかである
    [0070] 1
    [0071] 試料 反応性 ( Δ A545nm/30min)
    [0072] (pg/tube) A剤 B剤 C剤
    [0073] エン ド ト B因子及び
    [0074] グルカ ン * キシン ** ί ^体なし C因子抗体 C因子抗体
    [0075] 2.5 0.455 0.001 0.001
    [0076] 3.0 0.231 0.233 0.230
    [0077] 3.0 2.5 0.688 0.234 0.233
    [0078] *…カー ド ン * *― E. coli 0111:B4 由来 実施例 6
    [0079] ( 1 - 3 ) 一 3 — D —グルカ ンの測定
    [0080] 以下の方法で 2種類の試薬を調製し、 エン ド トキシ ン及び ( 1 → 3 ) 一 ）S — D —グルカ ンに対する反応性を比較検討した ( A剤は、 ライセ一 ト 、 塩化マグネシウム 440 モル、 Boc-Leu-Gly-Arg_pNA 2.86^モルを混合し、 凍結乾燥して調製 した。 D剤は A剤の成分に、 実施例 3で調製した精製 C因子に 対して中和能のあるモノ クローナル抗体を含む溶液 100^を添 加して、 凍結乾燥して調製した。
    [0081] 2種類の試薬それぞれを 2.2m£の 0.2M ト リ スー塩酸緩衝液 (PH 8.0) に溶解させ、 その溶液 0.1m£を試験管に分注し、 そ こへ試料 0.1； ^を添加してよ く 混合し、 37°Cにて 30分間反応さ せた。 2種類の試薬に対する試料の反応性は、 30分後に生じた PNA を 0.5^の 0.04%亜硝酸ナ ト リ ウム （ 0.48M塩酸） 、 0.
    [0082] 3%スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0.07% N - ( 1一ナフチル） エチ レ ン ジア ミ ンニ塩酸塩を順次添加して発色させ、 545nm の 吸光度値で示した。
    [0083] 第 2 図はエン ド トキシ ンに対する反応性を比較した実験結果 である。 A剤はェン ド トキシ ンに対して濃度依存的に反応する が、 D剤は 1, 000ng/ のェン ド トキシ ンに対しても全く 反応し ない。 この結果は、 精製 C因子に対するモノ ク ローナル抗体が、 ライセー ト中の C因子を完全に中和し、 ェン ド トキシ ンに対す る反応性を消失させていることを示している。
    [0084] 第 3図は、 A、 D両試薬の （ 1 → 3 ) — 一 D—グルカ ンに 対する反応性を用量反応曲線で比較した結果である。 2つの試 薬の用量反応曲線はほとんど一致しており、 このことは D剤に 含まれる精製 C因子に対するモノ クローナル抗体が、 ライセー 卜の （ 1 → 3 ) — — D—グルカ ンに対する反応性に全く影響 を与えないことを示している。
    [0085] 第 4 図は （ 1 → 3 ) — ； S— D—グルカ ンの蒸留水による希釈 系列と、 100ng/m のェン ド トキシ ン溶液による希釈系列に対す る D剤の用量反応曲線である。 2つの用量反応曲線はほとんど 一致しており、 このことは、 D剤を用いれば、 試料中に混在す るエン ド トキシ ンには全く 影響されずに （ 1 → 3 ) 一 β— Ό — グルカ ンを特異的に定量できる ことを示している。
    [0086] 以上の結果から、 精製 C因子に対するモノ ク ローナル抗体を 添加して調製した試薬を用いれば、 ェン ド トキシ ンの影響を全 く受けずに、 （ 1 → 3 ) — yS— D—グルカ ンを特異的に定量す ることができることは明らかである。
    [0087] 実施例 7
    [0088] ( 1 → 3 ) — — D—グルカ ンの測定
    [0089] 以下の方法で 2種類の試薬を調製し、 3種類の試料について その反応性を比較検討した。
    [0090] A剤は、 ライセー ト "0μ£、 塩化マグネ シウム 440 モルお よび Boc-Leu-Gly-Arg-pNA 2·86/ζモルを混合し、 凍結乾燥して 調製した。 Ε剤は、 実施例 4で調製した C因子不含ライセー ト 440 μ£、 塩ィ匕マグネ シ ウム 440 モル、 Boc-Leu-Gly-Arg-pNA
    [0091] 2·86/ζモルを混合し、 凍結乾燥して調製した。
    [0092] 2種類の試薬それぞれを の 0.2M ト リ スー塩酸緩衝液 ( PH 8.0) に溶解し、 その溶液 0.1 ^を試験管に分注し、 そ こ へ試料 0.1» ^を添加してよ く混合し、 37°Cにて 30分間反応させ た。 2種類の試薬に対する試料の反応性は、 30分後に生じた PNA を、 の 0.04%亜硝酸ナ ト リ ゥム （ 0.48M塩酸溶液） 、 0.3%スルフ ァ ミ ン酸ア ンモニゥム、 0.07% N — ( 1 —ナフ チ ル） エチレンジァ ミ ン二塩酸塩を順次添加して発色させ、 545 nmの吸光度値で示した。 その結果を第 2表に示した。 この結果 から、 C因子不含ライセ一トを用いて調製した試薬によれば、 エン ド トキシンの影響を全く受けずに、 （ 1 → 3 ) — β — Ό — グルカ ンを特異的に定量することができることは明らかである 2
    [0093] 試料 反応性 (△ A545nm/30min) Py / uUDe } Λ則 p ¾ m| エン ド ト C因子不含 グルカ ン * キシ ン ラ イ セー ト ラ イセー ト
    [0094] 2.5 0.455 0.001
    [0095] 3.0 0.231 0.232
    [0096] 3.0 2.5 0.688 0.233
    [0097] *…カー ドラ ン
    [0098] * * ― E. coli 0111:B4 由来
    [0099] 実施例 8
    [0100] 血漿検体の測定
    [0101] 対象は、 真菌による敗血症を疑った自治医大血液科に入院中 の重症血液疾患 （急性リ ンパ性白血病、 急性骨髄性白血病、 多 発性骨髄腫等） を有する患者の 1 1 例で、 それぞれ無菌的に採 血したへパリ ン加血液を試料と して、 4でで 150X G、 10分間 遠心して多血小板血漿（PRP) を得た。 その O.lmHこ 0.32Mの過 塩素酸 Ο·2^を加え、 37でで 20分間加温し、 析出物を遠心
    [0102] ( 3,000rpm、 10分間） 除去し、 その上清 0.05 に 0.18M NaOHを 0.05^加え中和し被検液と した。
    [0103] ひきつづき実施例 6 に記載の方法で調製した、 本発明による ( 1 - 3 ) 一； S— D—グルカ ン測定剤 0.1^を加え、 37。Cで 30 分間加温した。 この溶液に 0.04%亜硝酸ナ ト リ ウム （0.48M塩 酸溶液） 、 0.3%スルフ ァ ミ ン酸アンモニゥム、 0.07% N― ( 1 一ナフチル） エチ レ ンジァ ミ ン二塩酸塩の各 0 · 5J ^を順次加え てジァゾカ ツプリ ングし、 545nm でその吸光度を測定し、 別に 作成した検量線 （第 5図） の a より （ 1 → 3 ) — 3 — D—グル カ ン換算量と して表わした。 第 3表に示すように 1 1例全例に おいて高濃度の （ 1 → 3 ) — ^ 一 D —グルカ ンが検出され （健 常人 ： 0 · 2± 0 .3pg/m ) 、 そのうちの 5例 （ No. 1 〜 No. 5 ) は、 血培 ίこて、 カ ンジダ · ァノレビカ ンス ( Candida albicans ) ゝ 力 ン ジタ · グリ エノレモ ンディ （Candida guilliermondii ) 、 カ ン ジダ · 卜 ロ ピカ リ ス ( Candida tropicalis ) 、 カ ンジタ · ク ノレ セィ （ Candida krusei ) およびク リ プ ト コ ッ カス . ネオフ オ ル マ ンス ( Cryptococcus neof ormans )をそれぞれ検出し、 残りの 2例 （ Να 6 , Να 7 ) は血培では陰性であつたが、 死亡後の解剖 による組織病理学的検査によ り ァスペルギルス · フ ミ ガタス ( Aspergil lus fumigatus )を検出した。 さ らに残り 4例 （ tfe 8 〜Να 11) については、 臨床症状、 経過、 薬剤感受性等から真 菌感染を強く疑ったにもかかわらず、 血培では陰性であつたが、 抗真菌剤 （ア ンホテリ シ ン Β、 ミ コナゾ一ル、 フルコナゾール） 投与により、 臨床的に顕著な改善を見た。 従って、 本発明方法 はセルロース系透析膜による血液透析施行例 （第 4表の No. 1 ~ No. 5 ) を除いて、 真菌感染症と りわけ通常の検査法では診断が きわめて困難な深在性真菌感染症の迅速診断法と してきわめて 有力な手法と して評価されう るものであることが理解できょう。
    [0104] 日和見の深在性真菌症における血漿中 （ 1→ 3 ) - β - Ό -グルカン濃度
    [0105] No. 年令 性 疾患 顆粒球数 血漿 （ 1→ 3 ) — 血 培 備 考 予後 β — Ό—グルカン
    [0106] 1
    [0107] 丄 ΛΤ.Τ. 304.6pg/nrf (+ ) Candida albicans分離 广
    [0108] 9 MM 960 402.0 (+ ) Candida guilliermondii分 ¾g
    [0109] q ϋ fi1ノ Μ ΔΜΤ. 0 (+ ) Candida tropical is分離
    [0110] A 45ノ Μ t AiPtT J_l. 0 8寸7.6 (+ ) Candida k sei分離 土 ττ
    [0111] Ό AIHA 2560 525.6 (+ ) Cryptococcus neoformans 分離
    [0112] U 48/F ALL 0 49.2 (一） 全身性ァスペルギルス症 （死休角 死亡し
    [0113] 7 65/ F APL 0 145.1 (一） 全身性ァスペルギルス症 （死体解剖） 死亡
    [0114] 8 45/ F AML 6278 645.6 (-) フルコナゾ一ルにより改善 生存
    [0115] 9 52/ M ALL 6 76.5 (一） ミ コナゾ一ルにより改善 生存
    [0116] 10 32/ M AML 1 39.0 (一） ミ コナゾールにより改善 生存
    [0117] 11 29/ F ALL 0 264.4 (一） アンホテリ シン Bにより改善 生存
    [0118] A L L :急性リ ンノ 、°性白血病、 AML ： 急性骨髄性白血病、 AP L ：前骨髄球性白血病、
    [0119] MM ： 多発性骨髄腫、 A I HA ： 自己免疫性溶血性貧血
    [0120] 第 4 表
    [0121] セ レ口 スアセテー ト膜による血液透析患者の血中の （ 1 3 ) - /5 D—グルカ ン濃度
    [0122] Να ( 1 → 3 ) - β — Ό —グルカ ン
    [0123]
    [0124] 1 1528.0
    [0125] 2 2603.7
    [0126] 3 2051.5
    [0127] 4 1764.3
    [0128] 5 4028.0
    [0129] 実施例 9
    [0130] 尿検体の測定 自治医大に入院中に尿路感染症を併発した症例で、 尿培養で カンジ夕 · アルビカンス （ Candida albicans ) 、 カンジダ ' グ ラブレイタ （ Candida glabrata) を検出した 3症例につき、 本 発明方法による尿中 （ 1 → 3 ) — j8— D—グルカ ンの定量を行 つた。
    [0131] 尿は中間尿を無菌的に滅菌採尿コ ップに採取し、 その 0·005 に実施例 7 に記載の本発明方法による （ 1→ 3 ) - β - Ώ - グルカ ン測定剤 0.2^を加え、 37°Cで 30分間加温した。 実施例 8 と同様にジァゾカ ップリ ング後、 545nm でその溶液の吸光度 を測定し、 別に作成した検量線 （第 5図） の b より （ 1 → 3 ) 一 ；3— D—グルカ ン換算値と して表わした。 第 5表に示すよう に 3例中全例において高濃度の （ 1→ 3 ) 一 β — Ό — グルカ ン が検出され （健常人 ： lOpgZ 以下） 、 本発明方法は真菌性尿 路感染症の迅速確定診断法と して、 きわめて有力な手法である とが理解できよう。
    [0132] 第 5 表
    [0133] 真菌感染尿の尿中 （ 1 → 3 ) — /3— D—グルカ ン-濃度
    [0134] No. 検出菌 CFU* /rd ( 1 → 3 ) - β -
    [0135] D—グルカ ン （ng/π )
    [0136] 1 Candida albicans > 10< 25.5
    [0137] 2 Candida albicans > 10< 13.0
    [0138] 3 Candida glabrata > 10^ 16.7
    [0139] *コロニー形成単位 実施例 1 0
    [0140] 脳脊髄液検体の測定
    [0141] 自治医大に入院中に髄膜炎を疑われ、 髄液中にク リ プ ト コ ッ カス · ネオフ ォノレマ ンス ( Cryptococcus neoformans)を検出し た真菌性髄膜炎の 3症例につき、 本発明方法による （ 1 → 3 ) 一 ； 3— D—グルカンの定量を行つた。
    [0142] 腰推穿刺にて無菌的に採取した髄液 0.05^に注射用蒸留水 0 · 05^を加え、 さ らに実施例 5 に記載の本発明方法による
    [0143] ( 1 → 3 ) 一 /3— D—グルカ ン測定剤 0.1^を加え、 37°Cで 30 分間加温した。 実施例 8 と同様にジァゾ力 ッ プリ ング後、 545 nmでその溶液の吸光度を測定し、 別に作成した検量線 （第 5図） の b より （ 1 → 3 ) — ー D—グルカ ン換算値と して表わした。 第 6表に示すように、 3例中全例において高濃度の （ 1 → 3 ) 一 ；3— D—グルカ ンが検出され （健常人 ： 1 pgZ 以下） 、 本 発明方法は真菌性髄膜炎の早期迅速診断法と してきわめて有力 な手法と して評価され得る ものであることが理解できょう。 第 6 表
    [0144] 真菌感染髄液の髄液中 （ 1 → 3 ) — ー D—グルカ ン濃度
    [0145] Να 検出菌 ( 1 - * 3 ) — — D—グルカ ン
    [0146]
    [0147] 1 Cryptococcus neof ormans 120 . 5
    [0148] 2 Cryptococcus neof ormans
    [0149] 3 Cryptococcus neof ormans 105. 0
    [0150] 産業上の利用可能性
    [0151] 以上述べたように、 本発明はライセー トを用いた （ 1 → 3 ) 一 ー D—グルカ ンに特異的な測定剤を提供するものであり、 血液や尿、 髄液等の生体試料中に存在する真菌由来の （ 1 — 3 ) 一 ー D—グルカ ンを迅速簡便かつ高い精度で測定することが 可能であり、 菌培養法等に代表される通常の検査法では診断困 難な深在性真菌感染症の迅速な診断ならびに治 CD療効果の判定に 役立つもので、 特に臨床検査医学に貢献するところ大である。 さ らに本発明は、 注射用蒸留水、 医療用具および注射薬を汚 染した （ 1→ 3 ) —；3— D—グルカンを迅速かつ正確に測定す ることを可能と し、 また （ 1→ 3 ) — — D—グルカ ンに代表 される抗腫瘍多糖のスク リ ーニングにも有力な手法を提供する もので、 これらはいずれも本発明の副次的効果と して、 と く に 医薬品製造分野に貢献すると ころ大である。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    (1) カ ブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ライセー ト と、 エン ド トキシ ン感受性因子に対する抗体とからなる （ 1 → 3 ) — β - Ό ー グ ルカ ンの測定剤。
    (2) エン ド トキシ ン感受性因子に対する抗体を固定化した担体 に、 カ ブ トガニ · ァメ ボサイ ト · ラ イセー トを接触させて得た エン ド トキシン感受性因子不含ライセー トからなる （ 1 → 3 ) 一 — D—グルカ ンの測定剤。
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2/161281||1990-06-21||
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